Только Амброзиана может равняться с Врерой. Библиотека Амброзиана была основана племянником святого Карла Борромеи, кардиналом Федерико Борромеи. Первые 250 полотен, манускрипты и инкунабулами попали в пинакотеку в 1618 году от кардинала. Среди них были и оригиналы и некоторые копии. Одним из последних был добавлен очень интересный и ценный экземпляр — копия «Тайной вечери» Леонардо из трапезной монастыря Санта-Мария делле Грацие. Она была написана Веспино за некоторое время до вторжения наполеоновской армии и переоборудования монастырской трапезной в конюшню. Таким образом, в пинакотеке хранится копия, больше всего соответствующая изначальному виду этого полотна. Сейчас, спустя 4 века после открытия, Пинакотека представляет собой 24 зала, занимающие два этажа. В ней собраны работы Боттичелли, Леонардо, Тициана, картоны Рафаэля к ватиканской фреске «Афинская школа» и множество других работ.

В Амброзианской пинакотеке находится первый в мире натюрморт «Корзина с фруктами» Караваджо, которому кардинал Федерико хотел найти «соседа», но никто не мог исполнить эту работу лучше, чем Караваджо. Знаменитая картина «Букет» Япа Брейгеля, старшего сына Питера Брейгеля, согласно преданию, была написана в оранжереях герцога Брюссельского для одной бедной женщины, узнавшей про необычайные герцогские цветы, но знавшей, что никогда в жизни ей не представится возможности увидеть их вживую. В пинакотеке хранится множество картин Бернардино Луини, работы которого особо нравились кардиналу Федерико. Бернардино Луини был одним из немногих учеников Леонардо, «леонардесков», кто не забыл, чему учил их учитель и рьяно использовал особый, ангельский тип лица, впервые написанный Леонардо.

Его картина «Святое семейство со святой Анной и Иоанном Крестителем» в красках повторяет известный эскиз Леонардо из лондонской Национальной галереи, на котором Мария и Анна написаны как какое-то двутелое трехногое чудище. Сам же Леонардо представлен «Музыкантом»: на протяжении некоторого времени картина считалась портретом герцога Лодовико Моро. Рядом с ним висит работа другого ученика Леонардо, Джованни Амброджо де Предиса, «Женский портрет». Его авторство приписывали Леонардо, и картины считались парным изображением семейной пары — герцога и его жены Беатриче д'Эсге.